胞嘧啶碱基编辑器(CBE)是基因编辑技术中的重要组成部分,主要由四种成分构成:dCas9蛋白、sgRNA、胞嘧啶脱氨酶和尿嘧啶DNA糖基化酶抑制剂。这些成分在细胞内组装形成融合蛋白,在sgRNA的引导下,该融合蛋白与基因组DNA结合,导致靶序列形成单链结构。胞嘧啶脱氨酶将单链上的胞嘧啶(C)转化为尿嘧啶(U),而后通过DNA复制或修复的过程,U进一步转化为胸腺嘧啶(T),实现C-G碱基对到T-A碱基对的直接替换。
在研究CBE过程中,科学家们关注到产生的中间产物脱氧尿嘧啶(dU),开发了名为Detect-seq的脱靶检测技术。该技术首先从经过碱基编辑的细胞提取基因组DNA,并将CBE产生的dU进行生物素标记,这样便于富集目标片段。同时,在dU位点的下游,研究人员将正常胞嘧啶C替换为5-醛基胞嘧啶(d5fC),随后对d5fC进行化学标记为T,这使得在测序时可以发现大量的C-to-T突变信号,从而快速定位编辑位点。
与GUIDE-seq、Digenome-seq和Cas-OFFinder等技术相比,Detect-seq在灵敏度和特异性方面表现出色,能够检测Cas9依赖型和非依赖型的脱靶。此外,Detect-seq还具有检测sgRNA结合区域外编辑(out-of-protospacer edits)及靶向链编辑(target-strand edits)上的脱靶能力,展现出其全面性。
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