在2025年4月，湖南师范大学的杨荣华教授与邹振副教授领导的研究团队，在《Nucleic Acids Research》(IF=167)上，发表了一篇名为“Nonequilibrium hybridization-driven CRISPR/Cas adapter with extended energetic penalty for discrimination of single-nucleotide variants”的文章。这篇文章介绍了一种基于CRISPR/Cas12a的单核苷酸变异（SNV）检测平台——HEPSD（High-Energetic-Penalty SNV Detection Platform）。该系统采用双元crRNA结构设计，能够激活Cas12a的切割活性，并通过非平衡杂交实现单核苷酸错配信号的放大。

HEPSD平台在面对极端GC含量时，对难以检测的SNV（例如摇摆突变）显示出优异的区分能力，与传统的qPCR和下一代测序（NGS）在临床样本区分的准确性高度一致，准确率达到100%。这一成果表明了HEPSD在临床分子诊断中广泛应用的潜力，其设计原理同样能够拓展至其他CRISPR系统。

单核苷酸位点变异（SNVs）是常见的遗传变异形式，与多种严重疾病（如癌症、单基因疾病及传染病）的发生密切相关。目前的传统SNV检测方法（如TaqMan探针、分子信标、ARMS-PCR等）对某些难以检测的SNV（例如高GC含量区域的突变）并不适用。尽管CRISPR-Cas系统（如Cas12a）在核酸检测上有显著进展，但由于缺乏对所有单碱基错配的高特异性，其在实际应用中仍面临挑战。

HEPSD平台的基础是RNA/DNA双元探针，这种探针由长臂和短臂构成，专门设计用于选择性杂交以区分SNVs。研究表明，双元探针相比线性探针在更广泛（ΔT 40℃）和更低的温度范围内工作得更为有效。通过圆二色光谱的分析，发现双元探针能够在广泛温度范围内与靶向不匹配序列保持稳定结合。

在平台设计方面，基于双元探针的Cas12a系统激活性能，研究团队开发了HEPSD平台，并针对其激活机制进行了深入探讨。分子动力学模拟以及荧光各向异性分析表明，HEPSD能在匹配目标中形成稳定三元复合物，而在错配目标中则展现出动态不稳定性，有效抑制Cas12a的激活。此外，2-氨基嘌呤（2-AP）的荧光实验证实，HEPSD能仅在匹配情况下解旋DNA，从而避免Cas12a的误激活。

随后，研究团队对HEPSD的SNV检测性能进行了评估。结果显示，HEPSD能有效区分传统方法难以检测的SNV，包括高GC含量区域的突变和形成摇摆碱基对的错配，在GC含量低（30%）与高（70%）的背景下均表现出高特异性，检测限低至0.01%的突变等位基因频率（VAF）。此外，凝胶电泳和实时荧光实验结果显示，HEPSD对完全匹配的目标仍保持高效切割活性，而对错配目标几乎无活性。

为了更深入地评估HEPSD在实际应用中的有效性，研究人员选择了BRAFV600E和EGFRL858R作为靶突变。在104例BRAFV600E和28例EGFRL858R的临床样本（包括组织和血浆）中，HEPSD的敏感性和特异性均达到了100%，与qPCR和NGS的结果高度一致。其中，在血浆样本中，结合阻断置换扩增（BDA）技术，HEPSD成功检测到低丰度突变（VAF低至0.01%），性能优于传统qPCR方法。

本文介绍的HEPSD平台，通过创新设计的双元crRNA架构和引入的非平衡杂交调控机制，显著提高了对SNV的特异性识别能力。HEPSD在检测难以识别的SNV方面表现卓越，能够精准区分传统方法难以检测的错配类型，并在复杂的GC含量高达70%的区域维持优异的性能。本文研究成果显示，HEPSD不仅在癌症早期诊断和个性化治疗中提供了新的工具，更展现出在临床分子诊断领域的巨大潜力。

最终，HEPSD平台实现了对SNV的高灵敏、高特异性检测，尤其是在难检测突变及临床样本中展现了优异的表现。由人生就是博-尊龙凯时提供的支持，使得这些重要的研究成果得以实现，推动了医疗生物技术的进步。

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